Удлинитель потока: Удлинитель потока для радиатора VALTEC правый 3/4″

VT.503. VALTEC Удлинитель потока для радиаторов (алюминиевых и биметаллических) VT.503. VALTEC

(VT.503.D) Удлинитель потока VT.503 – уникальная разработка инженеров VALTEC. Его применение является оптимальным решением проблемы неравномерного прогрева многосекционных радиаторов с односторонним подключением (когда работают только нескольких секций, расположенных ближе к точкам подключения отопительного прибора). Удлинитель потока VT.503 представляет собой латунную никелированную радиаторную футорку, дополненную патрубком с внутренней треугольной резьбой крупного шага. В этот патрубок ввинчивается отрезок металлополимерной трубы с наружным диаметром 16 мм. Удлинитель потока устанавливается в обратный коллектор радиатора, тем самым создавая «псевдодиагональное» одностороннее подключение. Изделие выпускается в правом (D) и левом (S) исполнении для подключения труб или арматуры c диаметром условного прохода 1/2 и 3/4″.

Назначение и метод применения удлинителя потока для радиаторов

Удлинитель потока предназначен для создания «псевдодиагонального» подключения секционных (алюминиевых, биметаллических, чугунных) радиаторов систем водяного отопления в случаях, когда секции радиатора полностью не прогреваются. Причиной неравномерного прогрева секций радиатора является, как правило, недостаточный расход теплоносителя через отопительный прибор.

Установка удлинителя потока обеспечивает прохождение теплоносителя через все секции радиатора, независимо от расхода теплоносителя, что гарантирует равномерный прогрев секций.

Удлинитель потока представляет собой латунную никелированную радиаторную футорку, дополненную патрубком с внутренней треугольной резьбой крупного шага. В этот патрубок ввинчивается отрезок металлополимерной трубы с наружным диаметром 16 мм. Изделие выпускается в правом (D) и левом (S) исполнении для подключения труб или арматуры c диаметром условного прохода 1/2 и 3/4″.

Удлинитель рекомендуется устанавливать на выходе из радиатора. Перед установкой удлинителя в его патрубок необходимо вкрутить отрезок металлополимерной трубы Dн16. Длина отрезка должна быть равна длине радиаторной сборки, минус 80 мм.  При установке удлинителя  на радиатор  использование дополнительного уплотнительного материала не требуется, т.к. удлинитель снабжен силиконовым уплотнительным кольцом. Удлинитель потока устанавливается на отопительные приборы с внутренней  присоединительной резьбой G 1″. Купить удлинитель потока для радиатора можно в нашем магазине с доставкой по Киеву и Украине.

Удлинитель потока для радиатора | Санрай73

2020-11-25 10:33:06  
0  
598

Удлинитель потока VT.503 – уникальная разработка инженеров VALTEC. Его применение является оптимальным решением проблемы неравномерного прогрева многосекционных радиаторов с односторонним подключением (когда работают только нескольких секций, расположенных ближе к точкам подключения отопительного прибора). Удлинитель потока VT.503 представляет собой латунную никелированную радиаторную футорку, дополненную патрубком с внутренней треугольной резьбой крупного шага. В этот патрубок ввинчивается отрезок металлополимерной трубы с наружным диаметром 16 мм. Удлинитель потока устанавливается в обратный коллектор радиатора, тем самым создавая «псевдодиагональное» одностороннее подключение. Изделие выпускается в правом (D) и левом (S) исполнении для подключения труб или арматуры c диаметром условного прохода 1/2 и 3/4″.

Перед установкой удлинителя потока в радиаторный прибор, в патрубок ввинчивается металлопластиковая труба наружным диаметром 16 мм, из расчетов длинны радиатор мину 1 секция. Полученная конструкция устанавливается в обратный коллектор радиатора, создавая псевдо-диагональное одностороннее подключение. Теперь теплоноситель даже  при недостаточном напоре, не может покинуть радиатор не пройдя все секции.

Стоит обратить внимание еще на 2 момента. 1 — если непрогретая часть находится где-то на середине, то установка удлинителя потока, здесь не поможет, так как в радиаторе засорены вертикальные каналы непрогретых секций. Здесь поможет либо замена секций, либо замена радиатора целиком. 2 — в полностью прогретом радиаторе, удлинитель потока не нужен, даже на всякий случай. 

Удлинитель потока для биметаллического и алюминиевого радиатора Valtec VT.503

Удлинитель потока Valtec VT.503 – функциональное изделие нового поколения, благодаря которому легко разрешается проблема неравномерного нагрева многосекционных отопительных приборов с боковым односторонним подсоединением (когда функционируют всего-навсего пару секций, приближенных к месту подключения радиатора). Конструкция удлинителей состоит из латунной радиаторной футорки с никелевым покрытием, которую дополняет внутренне резьбовой патрубок (треугольная резьба с крупным шагом). Внутрь патрубка вкручивается часть металлополимерной трубы, внешний диаметр которой составляет 16 мм. Отрезок должен соответствовать длине радиаторной сборки, минус 60-80 мм. Детали VT.503 выпускаются левосторонние (S) и правосторонние (D) для подсоединения арматуры либо трубы с условленным проходом 3/4″ и 1/2″.

Назначение и метод применения удлинителя потока для радиаторов

Установка удлинителя потока выполняется в обратный коллектор секционного агрегата отопления (биметаллического, алюминиевого или чугунного радиатора) с внутренней присоединительной резьбой G 1/2″, что позволяет образовать «псевдо диагональное» одностороннее подключение в системах водяного отопления. Неравномерный прогрев многосекционного прибора обыкновенно возникает из-за недостаточного расхода теплоносителя через радиатор. Удлинитель потока содействует прохождению жидкости сквозь секции отопительного устройства, вне зависимости от расходов теплоносителя. Это дает гарантию равномерного прогрева всех секций прибора. В оборудование уплотнителей входит силиконовое уплотнительное кольцо, дополнительных уплотняющих материалов не требуется.  

Продукция Valtec характеризуется простотой монтажа, прочностью, долговечностью, устойчивостью к коррозийным процессам и техническим примесям, изготавливается на высокотехнологичном оборудовании, соответствует европейским стандартам качества. Приобрести удлинитель потока VT.503 с доставкой по Киеву и Украине можно на нашем сайте. По возникшим дополнительным вопросам проконсультируют наши специалисты.

 

nvie / gitflow: расширения Git для обеспечения высокоуровневых операций с репозиторием для модели ветвления Винсента Дриссена.

Коллекция расширений Git для обеспечения высокоуровневых операций с репозиториями.
для модели ветвления Винсента Дриссена.

Начало работы

Чтобы лучше всего начать работу с git flow , прочтите, пожалуйста, Джеффа
Сообщение в блоге Kreeftmeijer:

http://jeffkreeftmeijer.com/2010/why-arent-you-using-git-flow/

Или взгляните на один из этих снимков экрана:

Установка git-flow

Актуальные инструкции по установке см. В Wiki.

Интеграция с вашей оболочкой

Для тех, кто использует Bash или
ZSH shell, обратите внимание на отличную работу над
проект завершения потока git
пользователя bobthecow. Он предлагает завершение табуляции для всех
Подкоманды git-flow и имена веток.

FAQ

См. Раздел FAQ проекта
Вики.

Пожалуйста, помогите

Этот проект все еще находится в стадии разработки. Отзывы и предложения очень
добро пожаловать, и я призываю вас использовать вопросы
список на Github, чтобы обеспечить это
Обратная связь.

Не стесняйтесь разветвлять это репо и фиксировать свои дополнения. Для списка всех
авторов, см. файл АВТОРЫ.

Любые вопросы, советы или общие обсуждения можно разместить в нашей группе Google:
http://groups.google.com/group/gitflow-users

Участие

Форк репозитория. Затем запустите:

  git clone --recursive [email protected]: <имя пользователя> /gitflow.git
cd gitflow
git ветка master origin / master
git flow init -d
git flow feature start <ваша функция>
  

Затем продолжайте работу и зафиксируйте свои изменения. Подсказка : экспорт PATH = `pwd`: $ PATH
из каталога gitflow убедитесь, что вы используете версию
gitflow, который вы сейчас разрабатываете.

  git flow feature publish <ваша функция>
  

Когда закончите, откройте запрос на вытягивание в свою функциональную ветку.

Условия лицензии

git-flow публикуется в соответствии с либеральными условиями лицензии BSD, см.
ЛИЦЕНЗИОННЫЙ файл. Хотя лицензия BSD не требует, чтобы вы делились
любые изменения, которые вы вносите в исходный код, вас очень поощряют и
предлагается внести свои изменения в сообщество, желательно
в форке Github, конечно.

Инициализация

Чтобы инициализировать новое репо с базовой структурой ветвей, используйте:

  git flow init [-d]
  

Это затем интерактивно предложит вам несколько вопросов о том, какие ветви
вы хотели бы использовать в качестве ветвей разработки и производства, и как вы
хотел бы, чтобы ваши префиксы были названы. Вы можете просто нажать Return на любом из
эти вопросы, чтобы принять (разумные) предложения по умолчанию.

Флаг -d принимает все значения по умолчанию.

Создание ответвлений функций / выпуска / исправлений / поддержки

• Чтобы перечислить / начать / закончить функциональные ветки, используйте:

    функция потока git
    git flow feature start <имя> [<база>]
    git flow feature finish <имя>
    

  Для функциональных веток аргумент должен быть фиксацией на develop .

• Чтобы отправить / вытащить ветку функции в удаленный репозиторий, используйте:

    git flow feature publish <имя>
      функция потока git pull <удаленный> <имя>
    

• Чтобы перечислить / начать / закончить ветки выпуска, используйте:

    выпуск потока git
    git flow release start <выпуск> [<база>]
    git flow release finish <выпуск>
    

  Для веток выпуска аргумент должен быть фиксацией на develop .

• Чтобы перечислить / запустить / завершить ветки исправлений, используйте:

    исправление git flow
    git flow hotfix start <выпуск> [<база>]
    git flow hotfix finish <выпуск>
    

  Для веток исправлений arg должен быть фиксацией на master .

• Чтобы просмотреть / запустить ветки поддержки, используйте:

    поддержка потока git
    git flow support start <выпуск> <база>
    

  Для ветвей поддержки arg должен быть фиксацией на master .

Несколько человек уже запросили ее, и теперь она здесь: кнопка Flattr.

Конечно, лучший способ выразить признательность за оригинал.
сообщение в блоге или сам инструмент git-flow остается
вносить свой вклад в сообщество. Если вы хотите выразить свою признательность в
по-другому, однако, подумайте о Flattr’ing me:

Gitflow Workflow | Учебник Atlassian Git

Gitflow Workflow — это рабочий процесс Git, который помогает в непрерывной разработке программного обеспечения и внедрении методов DevOps.Впервые он был опубликован и популярен Винсентом Дриссеном на сайте nvie. Рабочий процесс Gitflow определяет строгую модель ветвления, разработанную для выпуска проекта. Это обеспечивает надежную основу для управления более крупными проектами.

Gitflow идеально подходит для проектов, у которых есть запланированный цикл выпуска, а также для наилучшей практики непрерывной доставки DevOps. Этот рабочий процесс не добавляет никаких новых концепций или команд, помимо того, что требуется для рабочего процесса Feature Branch. Вместо этого он назначает очень конкретные роли разным ветвям и определяет, как и когда они должны взаимодействовать.В дополнение к функциям веток, он использует отдельные ветки для подготовки, поддержки и записи выпусков. Конечно, вы также можете использовать все преимущества рабочего процесса Feature Branch: запросы на вытягивание, изолированные эксперименты и более эффективное сотрудничество.

Начало работы

Gitflow — это просто абстрактная идея рабочего процесса Git. Это означает, что он определяет, какие ветви создавать и как их объединять. Ниже мы коснемся целей веток.Набор инструментов git-flow — это фактический инструмент командной строки, в котором есть процесс установки. Процесс установки git-flow прост. Пакеты для git-flow доступны в нескольких операционных системах. В системах OSX вы можете выполнить brew install git-flow . В Windows вам нужно будет загрузить и установить git-flow. После установки git-flow вы можете использовать его в своем проекте, выполнив git flow init . Git-flow — это оболочка для Git. Команда git flow init является расширением команды git init по умолчанию и ничего не меняет в вашем репозитории, кроме создания веток для вас.

Как это работает

Разработка и управление ветвями

Вместо одной главной ветви этот рабочий процесс использует две ветви для записи истории проекта. В ветви master хранится официальная история выпусков, а в ветке develop служит ветвь интеграции для функций. Также удобно отмечать все коммиты в ветке master номером версии.

Первый шаг — дополнить master по умолчанию ветвью develop .Простой способ сделать это — один разработчик создать локально пустую ветку develop и отправить ее на сервер:

  разработка ветки git 
 разработка git push -u origin  

Эта ветка будет содержать полную историю проекта, тогда как master будет содержать сокращенную версию. Другим разработчикам теперь следует клонировать центральный репозиторий и создать ветку отслеживания для разработки .

При использовании библиотеки расширений git-flow выполнение git flow init в существующем репо создаст ветку develop :

  $ git flow init 
 Инициализированный пустой репозиторий Git в ~ / project /.git / 
 Ветвей пока нет. Базовые ветви должны быть созданы сейчас. 
 Имя ветки для производственных выпусков: [master] 
 Имя ветки для разработки «следующего выпуска»: [develop] 
 
 Как назвать префиксы поддерживающих веток? 
 Особенности веток? [feature /] Выпуск 
 веток? [release /] 
 Hotfix ветки? [hotfix /] 
 Поддержка веток? [support /] 
 Префикс тега версии? [] 
 
 $ git branch 
 * разработка 
 master 
  

Функциональные ветки

Каждая новая функция должна находиться в отдельной ветке, которую можно отправить в центральный репозиторий для резервного копирования / совместной работы.Но вместо ответвлений от master , feature ветки используют development в качестве родительской. Когда функция завершена, она снова включается в разработку. Функции никогда не должны напрямую взаимодействовать с master .

Обратите внимание, что включает ветвей в сочетании с develop ветвь для всех целей и задач является рабочим процессом Feature Branch. Но рабочий процесс Gitflow на этом не заканчивается.

Feature веток обычно создаются на основе последней ветки develop .

Создание функциональной ветки

Без расширений git-flow:

  git checkout develop 
 git checkout -b feature_branch  

При использовании расширения git-flow:

  git flow функция start feature_branch  

Продолжайте работу и используйте Git, как обычно.

Завершение функциональной ветви

Когда вы закончите разработку функции, следующим шагом будет объединение feature_branch с develop .

Без расширений git-flow:

  git checkout develop 
 git merge feature_branch  

Использование расширений git-flow:

  отделка функции потока git feature_branch  

Release Branch

После того, как development приобретет достаточно функций для выпуска (или приближается заранее определенная дата выпуска), вы ответите release ветвью develop . Создание этой ветки запускает следующий цикл выпуска, поэтому после этого момента новые функции не могут быть добавлены — в эту ветвь должны входить только исправления ошибок, создание документации и другие задачи, связанные с выпуском.Как только он будет готов к отправке, ветка release объединяется с master и помечается номером версии. Кроме того, он должен быть снова объединен с development , который, возможно, продолжал работать с момента запуска выпуска.

Использование выделенной ветки для подготовки выпусков позволяет одной команде доработать текущий выпуск, в то время как другая группа продолжает работать над функциями для следующего выпуска. Это также создает четко определенные фазы развития (например,g., легко сказать: «На этой неделе мы готовимся к версии 4.0» и на самом деле увидеть это в структуре репозитория).

Создание выпуска веток — еще одна простая операция ветвления. Подобно функция веток, релиз веток основаны на ветке разработки . Новую ветку выпуска можно создать с помощью следующих методов.

Без расширений git-flow:

  git checkout develop 
 git checkout -b release / 0.1.0  

При использовании расширений git-flow:

  $ git flow release start 0.1.0 
 Перешел на новую ветку release / 0.1.0  

Когда релиз будет готов к отправке, он будет объединен с master и development , после чего ветка release будет удалена. Важно снова выполнить слияние с development , потому что критические обновления могли быть добавлены в ветвь release , и они должны быть доступны для новых функций.Если ваша организация делает упор на проверку кода, это было бы идеальным местом для запроса на вытягивание.

Чтобы завершить ветку выпуска , используйте следующие методы:

Без расширений git-flow:

  мастер проверки git 
 выпуск слияния git / 0.1.0  

Или с расширением git-flow:

  git flow release finish '0.1.0'  

веток исправлений

Maintenance или «hotfix» ветки используются для быстрого исправления производственных выпусков. Hotfix ветки очень похожи на выпусков веток и имеют веток, за исключением того, что они основаны на master вместо development . Это единственная ветвь, которая должна разветвляться непосредственно от master . Как только исправление будет завершено, оно должно быть объединено как с master , так и с develop (или с текущей веткой release ), а master должно быть помечено обновленным номером версии.

Наличие выделенной линии разработки для исправления ошибок позволяет вашей команде решать проблемы, не прерывая остальной рабочий процесс и не дожидаясь следующего цикла выпуска.Вы можете думать о ветвях обслуживания как о специальных ветвях выпуска , которые работают напрямую с master . Ветвь hotfix может быть создана следующими способами:

Без расширений git-flow:

  git checkout master 
 git checkout -b ветка_отправки  

При использовании расширений git-flow:

  $ git flow hotfix start hotfix_branch  

Подобно завершению ветки release , ветка hotfix объединяется с master и development.

  git checkout master 
 git merge hotfix_branch 
 git checkout develop 
 git merge hotfix_branch 
 git branch -D hotfix_branch  

  $ git flow hotfix finish hotfix_branch  

Пример

Полный пример, демонстрирующий поток перехода функции, выглядит следующим образом. Предполагая, что у нас есть репо с веткой master .

  git checkout master 
 git checkout -b develop 
 git checkout -b feature_branch 
 # работа происходит в функциональной ветке 
 git checkout develop 
 git merge feature_branch 
 git checkout master 
 git merge develop 
 git branch -d feature_branch  9008

 
 В дополнение к функции ,  и , выпуск , пример исправления   выглядит следующим образом: 

 
  git checkout master 
 git checkout -b hotfix_branch 
 # работа выполнена коммиты добавлены в hotfix_branch 
 git checkout develop 
 git merge hotfix_branch 
 git checkout master 
 git merge hotfix_branch  
 Сводка
 
 Здесь мы обсудили рабочий процесс Gitflow.Gitflow - это один из многих стилей рабочих процессов Git, которые вы и ваша команда можете использовать.
 Некоторые ключевые моменты, которые нужно знать о Gitflow:
 Рабочий процесс отлично подходит для рабочего процесса на основе выпуска программного обеспечения.
 Gitflow предлагает выделенный канал для исправлений в производство.
 Общий поток Gitflow:
 Ветвь  develop  создана из  master 
 Выпуск  Ветвь  создана из  develop 
  Feature  веток созданы из  develop 
 Когда функция  завершена, она объединяется с ветвью  develop 
 Когда завершена ветвь  release , она объединяется с  develop  и  master 
 Если обнаружена проблема в  master  ветка  hotfix  создается из  master 
 После того, как исправление   завершено, оно объединяется с  develop  и  master 
 Затем узнайте о рабочем процессе Forking или посетите нашу страницу сравнения рабочих процессов.
 .flow Extension - Список программ, которые могут открывать файлы .flow 
 Расширение .flow - список программ, которые могут открывать файлы .flow
В следующей таблице вы можете найти список программ, которые могут открывать файлы с расширением .flow. Этот список создается путем сбора информации о расширениях, сообщаемой пользователями с помощью опции «отправить отчет» утилиты FileTypesMan. 
 Название продукта, описание и название компании взяты из информации о версии файла.exe-файл. Список «Действия» берется из пунктов контекстного меню, добавленных в Проводник указанной программой. В столбце «Популярность» отображается одно из следующих 4 значений: Низкое, Среднее, Высокое и Очень высокое, которое определяется в соответствии с количеству пользователей, отправивших указанную запись.
 В следующей таблице вы можете найти список информации о типах файлов, связанных с расширением .flow.
 Expression
.SketchFlow.flow.5.0
 Expression.SketchFlow.flow.12.0
 Expression Файл данных SketchFlow
 Blend.exe
 Blend для Visual Studio 2013, Microsoft Corporation
 High
 Expression.SketchFlow.flow.3.0
 Expression Файл данных SketchFlow
 Blend.exe
 Microsoft Expression Blend 3
 Низкий
 Expression.SketchFlow.flow.4.0
 Expression Файл данных SketchFlow
 Blend.exe
 Microsoft Expression Blend 4, Microsoft Corporation
 Medium
 Expression Файл данных SketchFlow
 Blend.exe
 Blend для Visual Studio 2012, Microsoft Corporation
 Низкий
 Ключи реестра, связанные с этим расширением
 HKEY_CLASSES_ROOT \ .flow 
 HKEY_CLASSES_ROOT \ Expression.SketchFlow.flow.12.0 
 HKEY_CLASSES_ROOT \ Expression.SketchFlow.flow.3.0 
 HKEY_CLASSES_ROOT \ Expression.CLASSES_ROOT_ROOT \ Expression.SketchFlow.flow.5.0
 Найдите дополнительную информацию о расширениях:
Если вы ищете информацию о другом расширении, вы можете попробовать найти его в
 следующий алфавитный список:
 А | B | C | D | E | F | G | H | Я | J | K | L | M | N | O | P | Q | R | S | Т | U | V | W | X | Y | Z | Другие |
 Применение API расширения потока к системам очистки 
 В своих предыдущих сообщениях в блоге я представил наш Flow Extension API, а затем поделился кратким руководством по оценке различных способов его применения.Итак, я думаю, что было бы очень полезно углубиться в детали, от конкретных приложений до реальных проблем. Как писал Кристофер Кроуфорд, « знаний без применения подобны книге, которую никогда не читают.  ”Применим его к налоговым счетам.
 Налоговые накладные принимаются во всем мире как средство борьбы с уклонением от уплаты налогов. Модель очистки преобладает в Азии и Латинской Америке, но мы все чаще наблюдаем ее и в Европе. Мы понимаем системы таможенной очистки как законные, в которых электронный счет должен быть отправлен в налоговую администрацию или ее лицензированному / аккредитованному агенту для авторизации до, во время или сразу после выдачи в качестве оригинального налогового счета.
 В ответ на эти проблемы Ariba Network может и дальше расширять свои возможности выставления счетов за счет партнеров и инструментов расширяемости, таких как API.
 Одним из приложений этого API является прерывание потока счетов-фактур для дальнейших проверок после создания онлайн-счета в Ariba Network.
 Таким образом, третья сторона или партнер может получить данные счета, а также прикрепленный юридический файл через Flow Extension API для юридических проверок, которые требуются налоговыми органами, прежде чем они будут приняты в юридические книги.Таким образом, покупатель может идентифицировать и отклонить фискально недействительный счет до его доставки.
 Если мы применим процесс оценки, изложенный в моем предыдущем сообщении в блоге.
 Сторонний поставщик выполняет следующие задачи и события API:
 Получить новые счета, представленные покупателю  (GetNextEvents) 
 Подтвердить эти документы  (Подтвердить) 
 Получить данные каждого события  (GetEventData) 
 Получите юридический файл, прикрепленный к каждому счету  (GetAttachments) 
 Выполните юридические проверки покупателя по этому файлу
 Публикация комментариев с результатами проверки для дальнейшей видимости  (PostDocumentUpdate) 
 Отклонить документ и остановить доставку  (Остановить) 
 ИЛИ возобновите поток, если действительный счет-фактура  (Резюме) 
 Это относится к счету-фактуре как тип документа Ariba Network
 Выбран следующий вариант использования, действия и этап: 
 
  Вариант использования 
  Действия 
  Поддерживаемый документ 
  Этап 
  Остановка удлинения потока 
 · Получить данные
 · Принять / отклонить ваш документ
 · Выполнить проверки
 · Оставить комментарии
 · Счет-фактура
 Предварительное размножение
 Этот процесс применяется к счетам-фактурам, которые соответствуют определенным критериям:
 Код страны ISO = PE (Перу), поэтому мы ограничиваем его одной страной
 Идентификатор адреса компании: «2026»
 Наконец, наш партнер или поставщик услуг получает доступ к Flow Extension API и вызывает события, перечисленные выше в (раздел 1, выделенный курсивом в скобках.
 Мировые тенденции ясно показывают, что страны все чаще применяют модель таможенной очистки с гармонизированной цифровизацией налоговой отчетности, а также финансовой и физической цепочки поставок. Это требует дальнейшего сотрудничества между всеми вовлеченными сторонами: поставщиками, покупателями и налоговыми органами. Таким образом, этот инструмент может быть полезен для расширения возможностей клиентов по обработке счетов-фактур, а также других документов, таких как уведомления об отправке или поступления товаров.
 Как мы видели, адекватный анализ в соответствии с предложенным процессом оценки помогает обеспечить лучшие результаты и снижает вероятность неприятных сюрпризов на этапе реализации.
 Создание потока - возможности расширения 
 Возможно, самый важный раздел портала, он позволяет пользователю создавать новые потоки, используя все доступные триггеры и действия.
 Чтобы создать поток, просто нажмите кнопку  «Новый поток»  на панели инструментов нижнего колонтитула:
 Мы увидим новую страницу, разделенную на два раздела:
 Раздел слева: определяет дорожную карту потока. Он состоит из пяти подразделов:
  Триггер:  Здесь пользователь может выбрать и настроить триггерную часть потока.
  Фильтр:  Этот раздел является динамическим, он может быть определен или нет, и позволяет пользователю останавливать поток в зависимости от вывода предыдущего шага действия, связанного с. Таким образом поток будет реагировать на более конкретные события.
  Условие:  Также динамический, этот раздел может быть определен или нет, и позволяет пользователю условно пропустить действие, с которым он связан.
  Действие:  Здесь вы определяете, как действовать при возникновении события.Этот раздел должен содержать как минимум одно действие.
  Обзор:  Здесь вы можете найти сводку о состоянии потока в любой момент.
 Раздел справа будет динамически изменяться в зависимости от того, какой раздел выбран слева, позволяя пользователю вводить значения, относящиеся к выбранной в данный момент области.
 Именование вашего потока 
 Вы должны дать своему потоку имя, чтобы его сохранить. Введите имя в области вверху раздела с левой стороны после того, как вы начали создавать новый поток.Рассмотрите хорошее описательное имя, так как оно будет его идентификатором внутри портала после того, как вы его сохраните.
 Триггеры 
 Первым шагом в создании нового потока является выбор типа триггера, который будет использоваться. Ваш выбор триггера определяет, что запустит ваш поток.
 Сначала выберите тип триггера.
 Настройте триггер, введя соответствующие свойства. Они являются динамическими и будут различаться в зависимости от типа настраиваемого триггера.
 Это экран, на котором вы выбираете триггер.
 Обратите внимание, что системные администраторы могут добавлять больше триггеров, чем показано здесь.
 На втором этапе можно определить требуемую конфигурацию для данного триггера.
 Вы можете вернуться и изменить тип триггера после входа в раздел конфигурации, просто нажав «Изменить триггер» в правом верхнем углу.
 Когда вся необходимая информация будет предоставлена, шаг «Триггер» будет отмечен зеленой галочкой в ​​секции слева.
 Фильтры и условия 
 Используя фильтры и условия, вы можете контролировать содержимое потоковых данных и / или останавливать выполнение при обнаружении нерелевантных данных.
 Чтобы добавить фильтр или условие, просто нажмите Добавить , фильтр,  или , условие  соответственно, и добавьте нужные фильтры / условия.
 В редакторе, используемом для ввода фильтров и условий, у вас будет возможность выбрать значения из предыдущих шагов в потоке, а также значения параметров, специфичных для арендатора.
 Фильтры 
 Добавляя фильтры, вы можете быть уверены, что к следующему шагу в потоке будут допущены только соответствующие объекты данных.
 Пример: если ваш поток актуален только для сотрудников-женщин, вы можете добавить этот фильтр:
 Обратите внимание, что  step0  представляет ваш триггер, а  {{step0: Body.gender}}  исходит из данных, проходящих через поток. Это будет иметь смысл только в том случае, если данные из триггера действительно имеют в своем теле свойство, называемое «пол».
 Условия 
 Добавьте условия, чтобы остановить выполнение потока при появлении определенных данных.
 Пример: если вы хотите, чтобы ваш поток не запускался для определенного пользователя, вы можете добавить это условие:
 Посетите эту страницу, чтобы увидеть больше примеров.
 Действия 
 Раздел действий разделен на два этапа, как и раздел триггеров:
 Выбор действия.
 Определение выбранного действия.
 Пользователь может перемещаться по этим двум разделам в любой момент, если он / она решит изменить используемое действие.
 В разделе конфигурации действия будут показаны все обязательные поля, необходимые для настройки действия.
 Если пользователю нужно использовать некоторые данные из ввода, ему / ей просто нужно будет добавить имя ввода в двойные фигурные скобки (например,  {{Step0: SomeData}} ). Когда фокус теряется из ввода, эти поля входных данных будут отображаться как чипы. Если указанный вход хорошо известен, он будет голубым, в противном случае - темно-синим.
 Кроме того, предложение будет добавлено в зависимости от вывода предыдущих шагов, поэтому пользователю не нужно запоминать структуру входных данных.
 Обзор 
 В этом разделе пользователь увидит сводку всего, что он / она настроил в процессе создания:
 Поток может быть сохранен, только если имя, триггер и все действия определены правильно.
 Переименовать название действия 
 Название действия можно изменить в любой момент. Когда пользователь добавляет новое действие, устанавливается имя по умолчанию. Чтобы изменить его, просто нужно щелкнуть имя, написать собственное имя и нажать кнопку сохранения потока, чтобы сохранить изменения.
 В разделе «Обзор
» будет отображаться сводка с использованием настраиваемых меток.
 Выход из создания потока 
 Если пользователь решает выйти из процесса создания, ему нужно просто нажать кнопку отмены, и появится диалоговое окно подтверждения, чтобы проверить, действительно ли он хочет выйти из процесса.
 Если триггеры генерируют дополнительные данные для потока, который должен быть запущен, он будет уведомлен пользователю после сохранения потока.
 Анализ движения связанных частиц с расширением потока для протеолиза одиночных молекул 
 Abstract 
 Регулируемый протеолиз сигнальных белков под действием механического напряжения позволяет клеткам взаимодействовать с окружающей средой в различных условиях развития и физиологических условиях.Роль силы в индуцировании протеолитической чувствительности была исследована с помощью магнитного пинцета на уровне одной молекулы с помощью тестов с привязкой к шарикам, но такие усилия были ограничены проблемами, связанными с обеспечением того, чтобы шарики не удерживались несколькими привязками. Здесь мы описываем мультиплексный анализ протеолиза одиночных молекул, который преодолевает проблему множественных тросов с использованием стратегии расширения потока (FLEX) на микроскопе, оснащенном магнитным пинцетом. Отслеживание частиц и вычислительная сортировка смещений, вызванных потоком, позволяет распределять привязанные субстраты в одноразовые и многосвязные бункеры, при этом доля полностью подвижных одинарных субстратов обратно пропорциональна концентрации субстрата, загруженного на покровное стекло.Вычислительное исключение многосвязных шариков позволяет надежно оценить протеолиз на мишени с помощью высокоспецифичной протеазы вируса травления табака и более неразборчивой металлопротеиназы ADAM17. Этот метод должен быть применим к широкому кругу протеаз и легко расширяемым для надежной оценки протеолитической чувствительности как функции приложенной магнитной силы.
 Введение 
 Силозависимый протеолиз чувствительных к натяжению доменов является фундаментальным механизмом передачи сигналов в биологии  1–4 .Напр., В ответ на сдвигающие силы в сосудистой сети, фактор фон Виллебранда подвергается протеолизу в своем чувствительном к силе домене, чтобы регулировать свертывание крови  5 . В сайтах межклеточного контакта, механочувствительный домен в рецепторе Notch подвергается регулируемому протеолизу в ответ на напряжение, прикладываемое связанным лигандом, влияя на решения клеточной судьбы во время развития  6-7 . В клеточном ответе на внеклеточный матрикс вызванное силой расщепление талина важно для механочувствительности и адгезионного ответа  8 .
 Учитывая важность силозависимого протеолиза в биологической передаче сигналов, мы стремились разработать надежный, одномолекулярный анализ протеолитического расщепления, который можно легко адаптировать для исследования протеолитической чувствительности в ответ на силу. В этом отношении методы магнитного пинцета с одной молекулой позволяют проводить прямые, комплексные наблюдения за зависимыми от напряжения биохимическими процессами в клеточных анализах или в очищенных системах  in vitro   9 . Эти подходы обычно основаны на захвате субстрата между зондом и анкерной поверхностью, обычно коллоидного шарика и покровного стекла соответственно.Одной из проблем, которая может затруднить эти анализы, является одновременный захват одной гранулы более чем одной иммобилизованной молекулой субстрата, так называемая «проблема множественных привязок», которая не учитывалась напрямую в предыдущих исследованиях мультиплексированного протеолиза одной молекулы  6, 10 .
 Для решения проблемы множественной привязки Деккер и его коллеги использовали микрорельеф для разделения точек привязки на основе длины контура простого ДНК-субстрата. Хотя этот подход обогащает одиночные привязи, он не устраняет многократно привязанные частицы  11 .Изучая распаковку нанопереключателей ДНК, Вонг и его коллеги использовали привязанное движение частиц и сигнатуру изменения длины, чтобы выполнить сортировку для спектроскопии центробежных сил  12 . Однако этот подход является узкоспециализированным и требует сложной специализированной аппаратуры, которая еще не коммерчески доступна.
 Мы представляем здесь простой и легко доступный подход к идентификации моновалентно связанных субстратов для одномолекулярной энзимологии и силовой спектроскопии, а также применяем наш метод для визуализации протеолиза одиночных молекул в реальном времени с помощью стандартного инвертированного микроскопа, оснащенного магнитным пинцетом (рис. 1).Мы захватываем гранулы на связанные с чипом субстраты протеазы в микрожидкостной камере и с помощью вычислений сортируем отслеживаемые прикрепленные к субстрату шарики, которые растягиваются потоком, показывая, что характерные смещения под потоком или сигнатуры расширения потока (FLEX) являются надежным методом для идентификации гранул. привязаны к одной молекуле субстрата. Затем мы демонстрируем специфический протеолиз связанных с шариками субстратов для двух различных классов протеаз. Этот метод должен быть универсальным подходом для сортировки предполагаемых субстратов для широкого диапазона протеаз или других гидролитических ферментов, и его следует применять в исследованиях, изучающих протеолитическую чувствительность как функцию силы, а также в классических экспериментах по спектроскопии силового зажима, измеряющих силу. адгезионных связей.
 Рисунок 1.
 Схема анализа расщепления с расширением потока (FLEX). Подробности подхода FLEX описаны в тексте. F  B , магнитная сила; F  D , сила сопротивления; L  0 , длина по контуру.
 Результаты 
 Для разработки надежного анализа с привязкой к гранулам для протеолиза одиночных молекул мы разработали подход, основанный на использовании расширения потока (FLEX), чтобы отличить гранулы, привязанные к одиночным субстратам, от гранул с несколькими привязками или гранулами. которые прилипают к поверхности проточной кюветы после захвата.В этом эксперименте выполняются два независимых измерения: во-первых, мы измеряем смещение гранул в анализе расширения потока, чтобы различать различные конфигурации привязи, а затем мы измеряем высвобождение гранул в анализе расщепления, проводимом с протеазой (рис. 1). Наш субстрат содержит длинную связку ДНК со встроенной полипептидной последовательностью между ручками ДНК, меченными дигоксигенином и биотином. Субстрат захватывается на поверхности нейтравидина с помощью биотинилированного конца ДНК, и затем к ним прикрепляются магнитные шарики, покрытые α-дигоксигенином F  ab , на конце, меченном дигоксигенином.Этот связанный с гранулами субстрат затем используется для мультиплексного протеолиза одной молекулы (рис. 1).
 Сборка ДНК-конъюгированного пептидного субстрата схематически проиллюстрирована на рисунке 2. Сначала мы связываем одноцепочечный олигонуклеотид с C-концевым цистеиновым остатком флуоресцентно меченного акцепторного пептида, используя модифицированный малеимидом нуклеотид ( 1  на рисунке 2A и рисунке S1). Затем мы соединяем наш субстратный пептид с этим конъюгатом акцептор-ДНК, используя эволюционировавшую Сортазу A (SrtA) ( 2  на Рисунке 2A и Рисунке S1).Снова с использованием малеимидного связывания второй одноцепочечный олигонуклеотид присоединяется к N-концевому цистеину этого конъюгата белок-ДНК с образованием пептидного субстрата с одноцепочечными олигонуклеотидами на каждом конце ( 3  на Фигуре 2A и Фигуре S1). После очистки на колонке для исключения размера эту молекулу затем лигируют с коротким дуплексом ДНК на N-конце и с XbaI-расщепленным фрагментом фага λ (23 998 п.н.) на С-конце. Лигирование модифицированного дигоксигенином олигонуклеотида с коротким дуплексом и биотинилированного олигонуклеотида с фрагментом фага λ приводит к получению субстрата с ручкой биотина для поверхностного прикрепления и ручкой дигоксигенина для захвата гранул анти-дигоксигенина ( 4  в Рисунок 2B).
 Рисунок 2.
 Схема, показывающая путь, используемый для приготовления ДНК-конъюгированных пептидных субстратов для протеолиза одиночных молекул. A. Синтетический способ получения конъюгата с двойным олигонуклеотидным пептидом. Продукт  1  представляет собой конъюгат полиглицина, содержащий остаток флуоресцеинированного лизина и С-концевой тиол (зеленый), связанный с 5’-малеимид-олиго (пурпурный). Продукт  2  представляет собой катализируемую сортазой А конъюгацию пептида-субстрата, содержащего С-концевой мотив акцептора сортировки LPXTG (красный), с полиглицин-олиго (зеленый-пурпурный).Продукт  3  (в рамке) представляет собой двойной олигонуклеотидный пептидный конъюгат, полученный путем связывания N-концевого цистеина  2  с 5’-малеимид-олиго (циан). Б. Синтез дигоксигенин-пептид-биотинового субстрата. Продукт  4  (в рамке) получен реакцией отжига и лигирования 5'-дигоксигенин-содержащего олигонуклеотида, короткого (100 п.н.) дуплекса ДНК и N-концевого олигонуклеотидного конца двойного олиго-пептидного конъюгата, а также одновременного лигирование С-концевого олигонуклеотида с расщепленным XbaI 24.Фрагмент фага λ размером 0 т.п.н. и концевой биотинилированный олигонуклеотид.
 Конечный субстрат для протеолиза содержит индивидуальный пептид, внедренный между дуплексами ДНК, которые вместе составляют 24098 пар оснований и имеют максимальную длину удлинения (L  0 ) 8,2 мкм, при условии 0,34 нм на пару оснований и 0,35 нм на аминокислоту. (Рисунки 1 и 2B). Модульная природа как N-, так и C-концевых фрагментов ДНК позволяет использовать многочисленные стратегии поверхностного прикрепления и выбирать ручки ДНК различной длины по обе стороны от субстрата.
 Чтобы подтвердить концепцию метода сортировки FLEX и оптимизировать условия для захвата одной бусинки, мы сначала исследовали контрольную связку, полностью состоящую из ДНК, сопоставимой длины, собранную аналогичным образом (рис. S2). Мы исследовали шарики, захваченные этими контрольными связями ДНК, загруженными в проточную ячейку, в четырех различных концентрациях в диапазоне от 0,2 до 25 пМ (рис. 3А). При каждой концентрации мы проводили эксперимент FLEX, измеряя положение отдельных шариков в отсутствие и при наличии потока, чтобы классифицировать траектории шариков на неподвижные (протяженность <1.6 мкм), частично подвижный (удлинение от 1,6 до 4,8 мкм) или полностью подвижный (удлинение от 4,8 до 8,7 мкм), устраняя слипшиеся шарики или траектории, которые были неполными в течение периода расширения потока (таблица S1). Данные траектории показывают, что загрузка субстратов в концентрации 0,2 пМ приводит к тому, что большинство одиночных шариков с полными траекториями попадают в категорию полностью мобильных, а концентрация 5 пМ или более приводит к многократному закреплению или неподвижности практически всех загруженных шариков. (Рисунок 3C, D; см. Также таблицу S1).Для полностью подвижных траекторий смещения соответствуют нормальному распределению (рис. 3C и 3D, зеленая популяция) 6,37 ± 0,54 мкм (среднее ± стандартное отклонение, n = 518). Также ясно, что существует обратная корреляция между долей полностью подвижных и неподвижных бусинок по мере увеличения концентрации связанных бусинок, что указывает на то, что по мере того, как наблюдается большее количество траекторий, появляется достаточно связанных субстратов, чтобы вызвать множественное связывание почти для каждой бусинки (рис. 3C). и 3D). В целом, анализ подвижности шариков показывает, что сигнатура FLEX является надежным методом определения того, привязан ли шарик к одной молекуле субстрата.
 Рис. 3.
 Движение связанного борта при расширении потока в зависимости от плотности привязи. А. Полулогарифмический график среднего количества захваченных шариков в шести полях обзора из проточных камер, инкубированных с увеличивающимися количествами dig-λ  XbaI  -биотина (0,2, 1, 5, 25 пМ), представленных как среднее ± SEM B. Графическое представление трех классов шариков, которые наблюдаются в каждом эксперименте, наряду с наложением относительных начальных (t = 0-200 с) и расширенных (t = 300-350 с) данных о положении по четырем траекториям из каждого класса смещения. : полностью мобильный (4.8-8,7 мкм, зеленый), частично подвижный (1,6-4,8 мкм, оранжевый) и неподвижный (<1,6 мкм, красный). C. Нормированные на вероятность гистограммы линейного смещения траекторий шариков при увеличении количества субстрата. Число траекторий частиц, отслеживаемых в 3-х повторах (среднее ± стандартное отклонение), указано над каждой гистограммой. D. Количественная оценка доли общих траекторий, которые были отсортированы по каждому классу смещения, представленных как среднее значение ± S.E.M. См. Также Таблицу S1.
 Затем мы использовали нашу процедуру сортировки FLEX для оценки протеолиза одной молекулы связанного с гранулами пептидного субстрата.Для подтверждения концепции мы собрали пептидный субстрат из 19 остатков, конъюгированный с двойной ДНК (см. Рисунок 2), содержащий консенсусный сайт расщепления протеазой вируса травления табака (TEV)  13  (ENLYFQ / G, с обозначенной ножницеобразной связью). обратной косой чертой) и подвергли этот субстрат расщеплению с помощью TEV (рис. 4). Гранулы, захваченные на ДНК-пептидном субстрате, демонстрируют распределение поведения FLEX (рис. 4A, B), при этом 63% связанных гранул (76/120) являются полностью подвижными. После обработки TEV (рис. 4C) популяция связанных субстратов (черный) показывает две кинетические фазы и остаточную популяцию примерно 45% шариков, которые остаются нерасщепленными через 10 мин.Вычислительная сортировка шариков на принятые и отклоненные шарики на основе их FLEX-траекторий показывает, что вычисленная отклоненная популяция (серый цвет) сопротивляется специфическому расщеплению TEV, тогда как полностью мобильная популяция (зеленый цвет) показывает более полное расщепление с остаточной популяцией шариков приблизительно 20 % нерасщепленных шариков через 10 мин. Принятая совокупность шариков демонстрирует скорость распада, которая намного быстрее, чем у отклоненной совокупности шариков (Рисунок 4C, сравните серую и зеленую кривые распада).Принимая во внимание, что принятая популяция молекул для специфического пептидного субстрата показывает быстрый распад с потерей ак   3,09 ± 0,03 × 10  -2  сек  -1  (n = 3, среднее ± 95% ДИ), принятые молекулы для контрольные субстраты, привязанные к гранулам, без пептида или связанные субстраты, обработанные буфером в потоке без добавления TEV, демонстрируют только медленные фазы потери гранул, которые почти эквивалентны (k  потеря  = 3,3 ± 0,2 × 10  -5  с  -1  для контрольного субстрата, содержащего только ДНК, n = 3, среднее ± 95% ДИ), вероятно, связано с диссоциацией взаимодействия анти-дигоксигенин / дигоксигенин (или нейтравидин / биотин) (рис. 4D).
 Рисунок 4.
 Улучшенный анализ протеолиза, катализируемого TEV, с использованием вычислительной сортировки подвижности гранул. A. Распределение расстояний распространения потока для связанных шариками молекул субстрата TEV. Полностью мобильное население показано зеленым, частично мобильное - оранжевым, а неподвижное - красным. B. Круговая диаграмма, показывающая процент принятых, частично подвижных и неподвижных бусин в привязанной популяции. C. Протеолиз связанных с гранулами субстратов при добавлении 20 мкМ протеазы TEV. Доля потерянных шариков представлена ​​как функция времени для общей популяции (черный), принятой (полностью мобильной) популяции (зеленый) и отклоненной популяции (серый).D. Анализ специфичности расщепления. Высвобождение гранул при расщеплении связанного пептидного субстрата показано синей сплошной линией, высвобождение привязанного полностью ДНК-субстрата показано фиолетовой пунктирной линией, а высвобождение гранул в отсутствие фермента указано серым. Кинетические следы нормализованы так, что t = 0 мин устанавливается равным 1 мин до начала потери валика и отображается как среднее ± стандартное отклонение для указанного числа испытаний (n = 2 или n = 3).
 Затем мы проверили, можно ли использовать нашу аналитическую систему для исследования протеолиза на уровне одной молекулы менее селективной протеазы ADAM17.ADAM17 катализирует расщепление ряда различных белков, участвующих во внутриклеточной передаче сигналов, включая предшественник эпидермального фактора роста, фактор некроза опухоли α и, при определенных патофизиологических контекстах, чувствительный к силе субстрат Notch2 человека  14-15 . В отличие от TEV, каталитический домен ADAM17 не распознает высокоспецифичную консенсусную последовательность и вместо этого способен расщеплять широкий спектр субстратов с предпочтением только объемного алифатического остатка в положении P1 ’(т.е.е. Вал или Иль)  16–18 .
 Субстрат ADAM17 содержит последовательность из десяти остатков Notch2 человека (NIPYKIEA / VQS, с разрезной связью, обозначенной обратной косой чертой), которая охватывает сайт расщепления металлопротеиназой (называемый S2  15, 19 ) с дополнительными короткими фланкирующими последовательностями, встроенными между N- и C-концевые ручки ДНК (рис. 2). Расщепление субстрата Notch2 с помощью ADAM17 показывает как быструю фазу высвобождения гранул, зависящую от концентрации ADAM17 в буфере для расщепления, так и медленную фазу (рис. 5А).Контрольные испытания высвобождения связанных шариков в отсутствие фермента, высвобождения шариков в присутствии как ADAM17, так и ингибитора металлопротеаз BB-94, или высвобождения шариков, привязанных к аналогу субстрата, содержащего только ДНК, показывают медленную фазу отсутствия -специфическое отщепление гранул, подтверждающее, что быстрая экспоненциальная фаза для катализируемого ADAM17 расщепления субстрата Notch2 обусловлена ​​специфическим протеолизом одной молекулы. Скорость катализированного ферментом высвобождения гранул, нанесенная на график как функция концентрации ADAM17, демонстрирует кинетику насыщения (рис. 5В) с расчетным значением k  max , равным 2.3 ± 0,2 × 10  −2  и EC50 для [ADAM17] 3,2 ± 0,7 × 10  −6  M (указано как среднее ± SEM, аналогично значениям для kcat и K  D , как предлагалось ранее  10  ).
 Рисунок 5.
 Одномолекулярный протеолиз субстрата Notch2 каталитическим доменом ADAM17. A. График высвобождения гранул в зависимости от времени с использованием различных концентраций фермента и контроля ДНК (пунктирная линия) или пептидного субстрата Notch2 (сплошные линии). Реакция расщепления (при концентрации ADAM17 10 мкМ), проводимая в присутствии ингибитора металлопротеиназы BB94, показана пурпурным цветом.B. Соответствие скоростей расщепления одиночных молекул из (A) как функции концентрации ADAM17 уравнению k  prot  = k  max  × [ADAM17] / (EC50 + [ADAM17]). Кинетические кривые показаны как среднее значение ± S.E.M для указанного количества испытаний (n = 2 или n = 3).
 Обсуждение 
 Здесь мы сообщаем о методе, который использует сортировку по расширению потока связанных шариков, чтобы обеспечить строгий анализ протеолиза одиночных молекул для двух различных ферментов и их субстратов. Наблюдаемые нами скорости расщепления согласуются с опубликованными исследованиями этих ферментов в экспериментах по протеолизу в массе  20–21 .Наш подход основан на вычислительной сортировке шариков, привязанных к субстрату, загруженных с низкой плотностью, с использованием их подвижности в потоке, чтобы исключить неподвижные или многократно связанные шарики и, таким образом, анализировать только шарики, привязанные к одной молекуле субстрата.
 В предыдущих исследованиях по измерению протеолиза субстратов, привязанных к гранулам, подходы к классификации различных гранул в пределах поля зрения не использовались, и поэтому было невозможно сделать серьезные заявления о моновалентности  6, 10 .Наши данные показывают, что валентность привязи очень чувствительна к концентрации субстрата, используемого для захвата в проточной ячейке. Даже когда молекулы, содержащие только ДНК, используются для анализа расширения потока, явное увеличение полностью подвижных гранул становится очевидным, поскольку снижение плотности прививки снижается до самой низкой концентрации нагрузки (0,2 пМ). Процедура FLEX позволяет эмпирически оптимизировать концентрацию субстрата для поддержания достаточного количества гранул для статистического мультиплексирования при минимизации количества гранул, отклоненных из-за поверхностной адсорбции или множественного связывания.В исследованиях, представленных здесь, мы смогли загрузить все молекулы ДНК в камеру, так что целых 202 полностью подвижных (из всего 355) связанных с ДНК шариков присутствовали в одном поле зрения. Даже пептидные субстраты с двойным олигонуклеотидным конъюгатом, которые, вероятно, будут более склонны к адсорбции из-за встроенных в них пептидных последовательностей, могут быть доставлены в проточную ячейку в концентрациях, достаточных для получения 120 полностью подвижных (из 165) связанных с субстратом шариков в единое поле зрения.Мы также отмечаем, что наши эмпирические данные согласуются со статистическими прогнозами о множественных привязках, сделанными с использованием модели идеальной поверхности, зависящей от плотности прививки субстратов и суммы контурной длины привязи и диаметра валика  22 .
 Использование сигнатуры расширения потока для выполнения вычислительного исключения шариков, которые не удерживаются одной привязью, приводит к заметному улучшению измерения кинетики расщепления субстрата (рис. 4). Этот подход должен быть особенно ценным для определения условий реакции, подходящих для исследования белковых или пептидных субстратов, склонных к адсорбции на поверхностях.Оптимизация условий реакции может быть осуществлена ​​путем выбора условий блокирования и вариантов субстрата, которые минимизируют количество временно или постоянно адсорбированных шариков, обогащая полностью подвижные шарики, которые достоверно сообщают о расщеплении одной молекулы субстрата во время реакции, катализируемой ферментами.
 Приведенные здесь аналитические инструменты должны легко адаптироваться для исследования любой гидролитической реакции, зависящей от напряжения, просто с помощью магнитного пинцета для изменения величины приложенной силы.Помимо тестирования механочувствительных доменов, наш анализ может быть использован для изучения стабильности пептидов и фолдамеров вторичных и третичных структурных элементов путем исследования силовой зависимости денатурации таких структурных элементов с использованием протеолитического расщепления в качестве заместителя. Можно представить себе два класса молекул с изменениями чувствительности к расщеплению: те субстраты, которые имеют скрытые сайты расщепления, которые открываются при денатурации или конформационном изменении  23–24 , или те субстраты, которые представляют продуктивный сайт расщепления только при складывании  25– 28 .
 Метод сортировки FLEX также должен быть применим для  in vitro  силовой спектроскопии одиночных молекул. Для экспериментов по разрыву связей не менее важно гарантировать, что только одновалентные взаимодействия оцениваются для оценки сцепления или гибкости в сравнении с поведением скользящей связи  3, 29–30 .
 Материалы и методы 
 Химические вещества 
 Биополимеры, синтезированные на заказ, были получены от Genscript или IDT и перечислены в таблице S2 вспомогательной информации.Сульфо-SMCC (сульфосукцинимидил-4- (N-малеимидометил) циклогексан-1-карбоксилат; 22322) и APMA (4-аминофенилртутилацетат; A9563) были от Sigma. BB-94 или батимастат был от Calbiochem (196440). NeutrAvidin (31000) был от Thermo Fisher. Fab против дигоксигенеина был приобретен у Roche (11214667001). Нанополоска была от КМГ (210034). Ключевыми реагентами для одномолекулярного рабочего буфера были бычий сывороточный альбумин, фракция теплового шока (A7906) и Pluronic F-127 (P2443) от Sigma. M-280 Активированные тозилом Dynabeads (14203) были от Invitrogen.SDS-PAGE анализ выполняли с использованием гелей Bolt 4-12% Bis-Tris Plus (Life Technologies, NW04125BOX) или 4-20% гелей трис-глицина (Bio-Rad, 456-1096). Денатурирующий ПААГ олигонуклеотидов и их конъюгатов выполняли с использованием гелей Novex 15% TBE-мочевина (Life Technologies, EC6885BOX). Колонны для обессоливания ПД-10 были от GE (95017-001). Колонки P-6 (7326221) и P-30 (7326223) Micro Bio-Spin были получены от Bio-Rad.
 Лямбда (λ) ДНК dam (-) была приобретена в New England Biolabs (N3013L).3-аминопропилтриметоксисилан был приобретен у Sigma (281778-100 мл). Метил-PEG5000-сукцинимидилвалерат (mPEG5000-SVA) и биотин-PEG5000-SVA (bioPEG5000SVA) были приобретены у Laysan Biosciences и хранились высушенными при -20 ° C. ), XbaI (R0145L) и XhoI (R0146S) были получены от New England Biolabs. Пентамутант SrtA с повышенной активностью экспрессировали и очищали от бактерий с использованием вектора pET29-eSrtA (Addgene, # 75144), как сообщалось ранее  31 .Протеаза TEV также рекомбинантно экспрессировалась в бактериях с использованием плазмиды pTrc-7H-PRO и очищалась, как описано  32 . Каталитический домен ADAM17 (остатки 215-477) выделяли после рекомбинантной экспрессии его формы-предшественника (1-477) с С-концевой гексагистидиновой меткой с использованием системы экспрессии бакуловируса в клетках насекомых. Очистку проводили в присутствии APMA, как описано  33 . Активность фермента подтверждали в объеме раствора с использованием флуорогенного субстрата (Mca-PLAQAV-Dpa-RSSSR-NH  2 ; R&D systems, ES003)  21 .Ферменты мгновенно замораживали и хранили при -80 ° C в аликвотах перед использованием.
 Индивидуально синтезированные биополимеры 
 Олигонуклеотиды, перечисленные в дополнительной таблице S2, были индивидуально синтезированы из Integrated DNA Technologies (IDT). Пептиды, перечисленные в дополнительной таблице S2, были синтезированы на заказ из Genscript и поставлялись с минимальной чистотой 95%. SMCC-активированные аминоолигонуклеотиды (активированные олигонуклеотиды, таблица S2) получали путем смешивания сульфо-SMCC (7,5 мМ, растворенного в диметилформамиде, с 300 мкМ аминоолигонуклеотида при 25 ° C в 10 мМ фосфатном буфере, pH 7.2, содержащий 150 мМ NaCl (PBS). Через 3-5 часов реакции активированный олигонуклеотид очищали от остаточного свободного сшивающего агента на обессоливающей колонке (ах) PD-10, предварительно уравновешенной PBS, концентрировали на центробежном фильтре MWCO 3 кДа и сразу использовали для конъюгирования пептидов.
 Другие материалы 
 Трубки из полиэтилена PE60 (Stoelting, 51162), покровные стекла № 1.5 VistaVision (VWR, 16004-312), двусторонняя лента (Grace Bio-Labs, 620001) и кварцевые крышки толщиной 1 мм были от Technical Glass. Товары.
 Подготовка покровных стекол и проточных камер 
 Покровные стекла № 1.5 были приготовлены путем первого травления стабилизированным раствором пираньи в течение 2 часов, затем силанизации предварительно гидролизованным 3- (аминопропил) триметоксисиланом в кислом метаноле и пассивирования путем алкилирования с помощью PEG  5000  -сукцинимид, содержащий 2-6 мол.% Биотинилированного ПЭГ  34–35 . Перед использованием покровные стекла хранили под вакуумом. Для создания проточных ячеек каналы 15 × 5 мм были разрезаны на двустороннюю ленту, ленту поместили между покровным стеклом и предметным стеклом, а входные и выходные порты были прикреплены к стеклу эпоксидной смолой, как описано  34, 36 .
 Синтез двойных олигонуклеотидных пептидных конъюгатов 
 Олиго-пептидный конъюгат ( 1 ) (фиг. 2; олигопептидный конъюгат 1, таблица S2) был синтезирован конъюгированием H  2  N-GGGK * GC-COOH (где остаток K * представляет собой ε- [5-амино-флуоресцеин (5-FAM)] - Lys) пептид-донор сортазы для активированного 5'-малеимидом олигонуклеотида из 17 пар оснований (активированный олигонуклеотид 1 и конъюгат пептид-олигонуклеотид 1, Таблица S2)  37 . Реакции конъюгации давали возможность протекать в течение 3 ч при 22-25 ° C в буфере PBS pH 7.2 (10 мМ фосфат, 150 мМ NaCl) с 1 мМ TCEP, содержащим 2 мМ (~ 15 экв.) Пептида 1 (Таблица S2) и 130 мкМ (1 экв.) Активированного олигонуклеотида 1 (Таблица S2). Для очистки конъюгата ( 1 ) (олигопептидный конъюгат 1, таблица S2) от свободного пептида, реакционную смесь заменяли на буфер HBS (25 мМ HEPES pH 7,5, 150 мМ NaCl) с помощью колонки для гравитационного обессоливания и очищали с помощью Эксклюзионная хроматография до очевидной гомогенности по оценке с помощью TBE-Urea PAGE. Конъюгат хранили при -80 ° C до использования.
 Для получения конъюгата олигопептид ( 2 ) (фигура 2; конъюгаты олигопептида 2-N и 2-T, таблица S2) конъюгат ( 1 ) был присоединен к С-концу либо Пептид Notch S2 (пептид 2, таблица S2) или пептид-субстрат TEV (пептид 3, таблица S2) в реакции транспептидации с использованием SrtA. Транспептидацию SrtA проводили в течение 4 ч при 42 ° C в HBS pH 7,5 с 10 мМ MgCl  2  и 4 мкМ NiCl  2  реакционным буфером с использованием 15 мкМ (1 экв.) олигопептидного конъюгата 1 ( 1 ), 150 мкМ (10 экв.) пептида 2 или 3 и 15 мкМ (1 экв.) eSrtA, аналогично ранее описанным методам  38–39 . После связывания конъюгат ( 2 ) дополнительно очищали с использованием обессоливающей колонки, которую также использовали для замены буфера на HBS [25 мМ HEPES pH 7,5, 150 мМ NaCl]. Чистоту оценивали с помощью анализа ТВЭ-мочевины в ПААГ. Конъюгат ( 2 ) хранили при -80 ° C до использования.
 Двойной олигопептидный конъюгат ( 3 ) был образован присоединением N-концевого цистеина конъюгата ( 2 ) к функционализированному 5'-малеимидом олигонуклеотиду из 20 пар оснований (активированный олигонуклеотид 2, Таблица S2), по существу, как описано выше для синтеза конъюгата ( 1 ), за исключением того, что активированный олигонуклеотид 2 использовали в огромном молярном избытке на этой стадии.Двойные олигопептидные конъюгаты Notch S2 и TEV ( 3 ) (фигура 2; олигопептидные конъюгаты 3-N и 3-T, соответственно, таблица S2) очищали с помощью эксклюзионной хроматографии до очевидной гомогенности, как оценивали денатурирующий ТВЕ-мочевина в ПААГ и хранили при -80 ° C.
 Производство дуплексных ДНК-субстратов с одной молекулой 
 Каждый конъюгат с двойным олигонуклеотидным пептидом ( 3 ) отжигали с мостиковым олигонуклеотидом (олигонуклеотид 3, Таблица S2), последовательностью, содержащей 5'-дигоксигенин из 100 пар оснований из pUC19  ori  область (олигонуклеотиды 4, 5 и 6; таблица S2), фрагмент, расщепленный XbaI из генома фага λ (λ  XbaI , 23998 пар оснований, 3.75 нМ, в масштабе 250 мкг), и последовательность cosR 3’-биотинового когезионного сайта (олигонуклеотид 7, таблица S2) в 20 мМ буфере HEPES, pH 7,5 (температура и время отжига были аналогичны ранее опубликованным методам  40 ). Перед отжигом все отожженные олигонуклеотиды со свободными 5 ’концами обрабатывали полинуклеотидкиназой Т4 в 1X буфере PNK в течение 1 часа при 37 ° C и очищали с помощью набора для очистки нуклеотидов Qiagen. Отожженную сборку лигировали 0,16 ед. / Мкл ДНК-лигазы Т4 в течение 2 часов при комнатной температуре.Полностью лигированный субстрат очищали от примесей с более низкой молекулярной массой (удаление свободного биотинилированного олигонуклеотида имеет решающее значение) заменой буфера на физиологический раствор с HEPES-буфером (HBS), pH 7,5, с использованием центробежного фильтра с отсечкой по молекулярной массе 100 кДа. Контрольный субстрат, полностью состоящий из ДНК, получали с использованием той же процедуры сборки и лигирования, используя вставку ДНК (олигонуклеотид 8, таблица S2) вместо двойного олигонуклеотидного конъюгата.
 Процедура захвата подложки и закрепления шариков 
 Проточные камеры были установлены на столике инвертированного микроскопа Olympus IX51 на воздушном столе (Technical Manufacturing Corporation) со смещенным от оси светодиодным осветителем на гусиной шее (Fisher) и магнитными пинцетами, изготовленными по индивидуальному заказу. , как описано ранее с небольшими изменениями  6 .Камеры были также оснащены шприцевым насосом (Harvard Apparatus) регулировал с помощью клапана запорного крана и пневматической рессоры 50 мл для регулирования потока текучей среды через проточную ячейку. Все изображения были получены с помощью камеры QIClick-R-F-M-12 Mono CCD (QImaging), управляемой с помощью программного обеспечения Micro-Manager  41 .
 Перед захватом субстратов на поверхности проточной кюветы камеру проточной кюветы сначала обрабатывали в течение минимум 10 мин 500 мкл блокирующего буфера (HBS, содержащий 0,5% (мас. / Об.) БСА и 1% (мас. / Об.) v) Плюроник F127) вручную втягивают в проточную ячейку.Затем камеру инкубировали в течение 3-5 минут с 80 мкл NeutrAvidin (0,1 мг / мл), введенными вручную в камеру, и промывали 500 мкл рабочего буфера (HBS, содержащий 0,1% (мас. / Об.) BSA и 1% ( w / v) Pluronic F127) при скорости потока 100 мкл / мин. Субстрат разбавляли рабочим буфером (конечная концентрация от 0,15 до 15 пМ), и общий объем субстрата составлял 100 мкл в камеру сначала со скоростью 20 мкл / мин в течение одной минуты, чтобы очистить впускную трубку, и со скоростью 5 мкл / мин. после этого перед инкубацией в камере еще 2-5 мин.Затем камеру промывали рабочим буфером в течение 10 мин при скорости потока 50 мкл / мин.
 Чтобы подготовить шарики для захвата, активированные тозилом 2,8 мкм Dynabeads конъюгировали с анти-дигоксигенином F  ab  и хранили в PBS с 0,01% (мас. / Об.) BSA при 4 ° C, как описано (в соответствии с протоколом производителя. and Tanner, N. и van Oijen, A. (2010)  34 ). Непосредственно перед использованием шарики разбавляли до 10 мкг / мл в рабочем буфере, встряхивали и обрабатывали ультразвуком для минимизации комкования. Затем суспендированные шарики (~ 250 мкл) втягивали в камеру со скоростью 20 мкл / мин.Камера была выровнена по направлению потока, чтобы гарантировать, что шарик, движущийся через камеру, не перемещается более чем на половину своего диаметра по всему полю зрения (fov). Затем камеру промывали 400 мкл рабочего буфера со скоростью 30 мкл / мин. После стадии промывки поток останавливали, чтобы позволить шарикам расслабиться из своего вытянутого положения (обычно на 5-10 минут). После выключения шприцевого насоса 5-миллиметровый кубический магнит из NdFeB на шарнирном креплении был расположен на 9 мм над покровным стеклом с помощью микрометра (что эквивалентно приблизительно 0.6 пН приложенной силы перпендикулярно покровному стеклу), чтобы шарики оставались над поверхностью. Сила была оценена с дигоксигенин-λ-биотином (48 502 п.н., полная длина, полученная, как описано в  40 ) привязи на основе различия в положении борта (〈 σ  y    2 〉) в направлении, поперечном приложенная сила в соответствии с методом, опубликованным Strick et al.  42 .
 Процедура увеличения потока одной молекулы 
 Для экспериментальных экспериментов по увеличению потока (рис. 3, дополнительный видеоролик V1), дополнительный буфер был добавлен во впускное отверстие после загрузки субстрата и захвата шариков, а клапан открывался и закрывался для уравновешивания давления в проточной ячейке.Затем был инициирован сбор данных со скоростью 2 кадра в секунду, первоначально при отсутствии потока, но с установленным магнитом (рис. 1), чтобы можно было определить начальное положение каждого отслеживаемого шарика. Во время открытия клапана (при t = 200 с) буфер втягивали в камеру со скоростью 5 мкл / мин, используя шприцевой насос, чтобы вызвать расширение потока. Расширение под потоком достигает равновесия примерно через 4 мин. Через 5 минут фиксировали положение валика при растяжении.
 Анализ и сортировка профилей бусинок расширения потока 
 Наборы данных покадровой съемки были проанализированы с помощью специальных сценариев MATLAB, написанных для этой работы, доступных по запросу.Обнаруженные частицы были идентифицированы и проанализированы с помощью алгоритмов отслеживания коллоидных частиц, разработанных Cocker, J.C. и Grier, D.G.  43 , которые были адаптированы для MATLAB компанией Kilfoil, M.  44 . Траектории монодисперсных частиц проверялись вручную, чтобы гарантировать высокое качество результатов отслеживания, с использованием пакета msdanalyzer, созданного Tinevez, J.-Y.  45 .
 Траектория расширения потока каждого монодисперсного шарика была проанализирована для определения его линейного смещения.В частности, оценивались только траектории шариков, которые начинались в первом кадре (t = 0 с) полученных данных и сохранялись в течение времени, необходимого для удлинения шарика (t = 200 с). Среднее начальное (от 0 до 200 с) и расширенное (от 300 до 350 с) положения определяли путем подгонки положений шариков к распределению Гаусса. Линейные перемещения потока были рассчитаны путем измерения расстояния между этими средними положениями. Смещения были измерены с точностью до субпикселя ( σ  σ  RMSE   ) и точностью  22 .
 На основе их среднего смещения анализируемые шарики были разделены на принятые (полностью подвижные [8,7–4,8 мкм]) и отвергнутые (частично подвижные [4,8–1,6 мкм] и неподвижные [1,6–0 мкм]) популяции. Гистограмма смещений для популяции привязанных субстратов всегда проверялась, чтобы качественно оценить характер распределения относительно фракции в каждой популяции. Среднее расширение для качественной полностью мобильной популяции обычно составляло 6,0-6,5 мкм (L / L  0  = 0.73 - 0,79), принимая L  0  = 8,20.
 Одномолекулярный протеолиз с TEV 
 Непосредственно перед использованием протеазу TEV заменяли буфером для резки TEV (25 мМ HEPES pH 7,5, 25 мМ NaCl и 0,01% (мас. / Об.) Pluronic F-127) с помощью Вращающаяся колонка P-6 для удаления остаточного TCEP, присутствующего во время хранения, а затем разбавленная до концентрации 20 мкМ перед введением в проточную ячейку. После загрузки субстрата и захвата шариков в проточную кювету вводили TEV со скоростью 5 мкл / мин и отслеживали траектории шариков для отнесения к мобильным, частично подвижным или неподвижным категориям.Затем поле зрения контролировали на предмет потери шариков как функции времени для получения графиков расщепления на Фигуре 4 (см. Также дополнительный видеоролик V2).
 Одномолекулярный протеолиз с помощью ADAM17 
 ADAM17 разбавляли до соответствующей концентрации в буфере для разрезания металлопротеаз (HBS с 4 мкМ ZnCl  2  и 1% (мас. / Об.) Pluronic F-127) непосредственно перед использованием и переливали в камеры для создания графиков расщепления на фиг. 5. Поток фермента в камеру был остановлен примерно через 25 мин, но траектории отслеживались в течение всего 45 мин, чтобы извлечь константу скорости для медленной экспоненциальной фазы.Чтобы подтвердить, что расщепление происходит за счет ADAM17, использовали ингибитор металлопротеиназы BB-94 в концентрации 20 мкМ.
 Аппроксимация кривой для данных о расщеплении 
 Кривые потерь в шариках были подогнаны к двойной экспоненте с использованием нелинейной аппроксимации методом наименьших квадратов, где константа быстрой скорости соответствует k  prot . Начало потери валика определяли для каждой кривой вручную. Для кривых выпадения гранул, измеренных в отсутствие фермента или в присутствии ингибитора, аппроксимация соответствовала одной экспоненциальной зависимости в течение 15 мин.Для экспериментов с ADAM17 график зависимости k  prot  от концентрации фермента соответствовал:
для извлечения k  max  и EC50, которые аналогичны k  cat  и K  D , как описано ранее  10 .
 СВЯЗАННЫЙ СОДЕРЖАНИЕ 
 Вспомогательная информация доступна бесплатно на веб-сайте ACS Publications и включает следующее:
 Вспомогательные рисунки S1 и S2, вспомогательные таблицы S1 и S2, легенды вспомогательных фильмов V1 и V2, объединенные в один файл PDF.
 Поддерживаемые фильмы V1 и V2 (тип файла AVI)
 ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРЕ 
 Автор для корреспонденции 
 * Кому следует обращаться. Электронная почта: joseph_loparo {at} hms.harvard.edu и stephen_blacklow {at} hms.harvard.edu
 Вклад авторов 
 Концепция проекта: все авторы; экспериментальный дизайн: все авторы; сбор данных, A.A.D .; интерпретация и анализ данных: все авторы; Подготовка рукописи: все авторы; финансирование: С.C.B. и J.J.L.
 Источники финансирования 
 Поддерживается грантами NIH (R35 CA200340 для S.C.B. и R01 GM114065 для J.J.L). S.C.B. получает финансирование исследований для несвязанного проекта от Novartis и является консультантом в несвязанном проекте IFM Therapeutics.
 БЛАГОДАРНОСТИ 
 Авторы благодарят Тома С. М. Сигара за предоставление бакуловируса, используемого для производства ADAM17, Эндрю Морено за помощь с кодированием, а также Томаса Г. В. Грэма и Дэна Сонга за помощь в приготовлении проточной кюветы.Эта работа поддерживается NIH R35 CA220340 (для S.C.B.) и R01 GM114065 (для J.J.L.).
 Удлинительный провод серии Flow, 6 футов - AutoLEDTech.com 
 Дома
 ›
 Удлинительный провод 6 'серии Flow
 7,99 долл. США
 Сравнить с 10,00 $
 Заголовок по умолчанию - 7 долларов.99 долларов США
 Этот удлинительный провод с 3-9 контактами   позволяет увеличить радиус действия проводки на 6 футов, позволяя компонентам Flow Series дотянуться до основного жгута с противоположной стороны автомобиля. Пожалуйста, выберите количество, которое вам нужно, исходя из количества компонентов, которые вам нужно будет расширить. Приобретите его для любого из наших продуктов серии Flow.
  Объем заказа: 
  (1)   3-контактный удлинитель серии Flow, 6 дюймов 
 Сопутствующие товары 
 Посмотреть больше
 Из
 59 долларов.99
 24,99 доллара США
 Из
 120,00 долларов США
 .